Cromatografía de afinidad
Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimáticos, lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados, retienen a los solutos (analitos), también de naturaleza bioquímica, de manera reversible y selectiva. Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular.
Fundamento de la cromatografía de afinidad
En la figura se muestra de forma esquemática el fundamento de las separaciones mediante cromatografía de afinidad. Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos; se eluye así el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la regeneración de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida.
La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas
• Alta selectividad en el mecanismo de retención
• Campo de aplicación restringido
• Separación de un solo soluto analito
• Empleo de sistema de baja presión
• Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica
Ligandos de afinidad
Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte, y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza, pueden ser macromoléculas biológicas o bien moleculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas, respectivamente. Y según su actuación. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad; se distinguen dos grandes grupos: Ligandos específicos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos.

Esquema de un cromatograma de afinidad.
Soportes
El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, tamaño del grano controlable, porosidad controlable, carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta presión.
El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.
Inmovilización de ligandos
La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene connotaciones específicas.
El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté lo más lejos posible de la zona activa de bioadsorción.
El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud.
La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales:
- Activación del soporte, que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados, que se caracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. De la gran variedad de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre la matriz de polisacárido. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes: ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos, según reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa produce en un disolvente orgánico o en mezclas con agua. Luego sigue el anclaje químico del ligando que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo, fundamentalmente con el soporte activado.
Metodos de elución
Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna, cave distinguir los procedimientos generales de elución como:
Elución bioespecífica: La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular, produciéndose en todos los casos una elución por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o no, con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. Se distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida.
La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito, que es la situación más frecuente. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso molecular, y eluida con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del analito, por lo que es retirada del sólido y eluida. Ejemplo, la purificación de la lectina.
La elución invertida, se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad. El cual es una biomacromolécula que retienen específicamente el analito. La presencia del inhibidor en la fase móvil provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para purificar glucoproteína.
En la elución no bioespecífica, la fase móvil provoca la denaturación del ligando inmovilizado, del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo, de tal manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de las causas que la provocan.
NOMENCLATURA IUPAC PARA CROMATOGRAFIA
TERMINO
Cromatografía. La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida.
Cromatógrafo. El instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica.
Cromatógrama. Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector, la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografía plana, "cromatógrama" puede referirse al papel o capa con las zonas separadas.
Fase Ligada. Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las partículas de soporte o a la pared interior de la columna.
Fase Inmovilizada. Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ (entrecruzamiento químico) tras un recubrimiento.
Fase Móvil. Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en una dirección definida. Puede ser un líquido (Cromatografía Líquida), un gas (Cromatografía de Gases) o un fluido supercrítico (Cromatografía con Fluido Supercrítico). En la cromatografía de gases se uede usar la expresión Gas Portador para la fase móvil. En la cromatografía de elución se usa también para la fase móvil la expresión Eluyente.
Eluir. Aplicar la cromatografía de elución. El proceso de elución se puede detener mientras todos los componentes de la muestra están aún en el lecho cromatográfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se prefiere el término "Eluir" a "Desarrollar", término usado en nomenclaturas anteriores de cromatografía plana.
Efluente. La fase móvil que abandona la columna.
Muestra. Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil.
Componentes de la Muestra. Los constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. Se aceptan también los términos Eluito y Analito para un componente de la muestra
Métodos principales
Cromatografía Frontal: Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatográfico. No se utiliza ninguna fase móvil adicional
Cromatografía de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido más fuertemente que los componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta, como una pequeña cantidad en un intervalo breve.
Cromatografía de Elusión: Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequeña cantidad en un tiempo breve.
Clasificación de acuerdo al lecho cromatografico
Cromatografía en Columna: Técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo. Las partículas de fase estacionaria sólida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria líquida, pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo largo de su pared interna, dejando una ruta abierta, no restringida, para el paso de la fase móvil por el centro del tubo (Columna Tubular Abierta).
Cromatografía plana: Técnica de separación en la que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un plano. Éste puede ser un papel, que sirva como tal o que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria (Cromatografía en Papel), o una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio (Cromatografía en Capa Fina, TLC). A veces a la cromatografía plana se la llama también Cromatografía de Lecho Abierto.

CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Esta técnica es la más confiable. Se utiliza al cromatógrafo de gases como separador de la muestra desconocida en sus componentes El espectrómetro de masas ioniza los componentes separados y realiza un barrido electrónico de todos los iones para ubicar iones de BPCs comparando sus masas teóricas.
Esta es una técnica absoluta y muy confiable ya que realiza el barrido de todos los congéneres basándose en el hecho de que la muestra es una familia de isómeros. Los isómeros son dos o más moléculas que tienen el mismo peso molecular pero diferente estructura. Al barrer electrónicamente solamente 10 pesos moleculares se obtiene un resultado absoluto. Sin lugar a dudas este es el medio más seguro para detectar y cuantificar BPCs.
Espectrometría


Dispersión de luz en un prisma triangular
La espectroscopia surgió con el estudio de la interacción entre la radiación y la materia como función de la longitud de onda (λ). En un principio se refería al uso de la luz visible dispersada según su longitud de onda, por ejemplo por un prisma. Más tarde el concepto se amplió enormemente para comprender cualquier medida en función de la longitud de onda o de la frecuencia. Por tanto, la espectroscopia puede referirse a interacciones con partículas de radiación o a una respuesta a un campo alternante o frecuencia variante (ν). Una extensión adicional del alcance de la definición añadió la energía (E) como variable, al establecerse la relación E=hν para los fotones. Un gráfico de la respuesta como función de la longitud de onda (o más comúnmente la frecuencia) se conoce como espectro.

La espectrometría es la técnica espectroscópica para tasar la concentración o la cantidad de especies determinadas. En estos casos, el instrumento que realiza tales medidas es un espectrómetro o espectrógrafo.

La espectrometría a menudo se usa en física y química analítica para la identificación de sustancias mediante el espectro emitido o absorbido por las mismas.

La espectrometría también se usa mucho en astronomía y detección remota. La mayoría de los telescopios grandes tienen espectrómetros, que son usados para medir la composición química y propiedades físicas de los objetos astronómicos, o para medir sus velocidades a partir del efecto Doppler de sus líneas espectrales.

inmunodeteccion elisa

El método de ELISA se fundamenta en el uso de anticuerpos específicos para capturar a la proteína de interés. Este procedimiento es capaz de discriminar proteínas específicas presentes en el producto bajo análisis, de entre cientos de proteínas distintas presentes en la misma muestra. El método de ELISA es extremadamente sensible, versátil y cuantitativo. En general, este procedimiento, incluye el uso de anticuerpos que se unen de manera específica a las proteínas de interés (llamados anticuerpos primarios), por ejemplo a aquellas que son sintetizadas como resultado de la introducción del nuevo ADN (llamadas proteínas transgénicas). Una reacción colorimétrica o fluorimétrica desencadenada por un segundo anticuerpo (o anticuerpo secundario) permite visualizar y medir la cantidad de la proteína de interés. El resultado se compara con la señal emitida por concentraciones conocidas de la misma proteína, por lo que el ensayo no solo es cualitativo, si no también cuantitativo. Una restricción para el uso de pruebas de ELISA en la detección de proteínas transgénicas es la desnaturalización de estas durante el procesamiento del alimento. Los resultados de esta prueba se estima que son confiables en un 95% de los casos sometidos
Tabla 2: Características de los métodos ELISA en la detección de OGM
Propósito Identificar y semicuantificar una proteína específica relacionada a un rasgo genéticamente modificado.
Ventajas Moderada preparación de la muestra.
Ensayo relativamente rápido (2-4 horas incluyendo la preparación de la muestra).
Cualitativo o semicuantitativo.
Costo relativamente bajo o medio.
Ensayo de formato robusto y simple.
Conveniente y rentable para el análisis de numerosas muestras.
Económicamente comparado con los métodos de detección de ADN.
Se requiere menos habilidad que para los métodos de detección de ADN.
Equipamiento más barato que para los métodos de detección de ADN.
Desventajas Menos sensible que los métodos de detección de ADN.
Los juegos diagnósticos son almacenados a 4°C.
Costo moderado del equipamiento que requiere un lector de placas de ELISA.
Falta de disponibilidad de anticuerpos relevantes.
La cuantificación puede ser cuestionable, ya que puede estar influenciada por factores externos como el clima, las condiciones del suelo y la disponibilidad de nutrientes.
El desarrollo de anticuerpos apropiados puede demorar de meses hasta años.
Pueden existir falsos positivos, debido a contaminaciones cruzadas con otros componentes de la muestra analizada.
Limitaciones Las pruebas ELISA no son evento específico.
La sensibilidad es de ~ 0.5 a 1% de OGM.
Algunos OGMs no expresan niveles detectables de la proteína blanco y otros expresan la proteína de forma muy limitada o no la expresan en todas las partes de la planta.
Los juegos comerciales están disponibles para un número limitado de OGMs.
La producción de anticuerpos es lenta y difícil.
La mayoría de los ELISA detecta una sola proteína cada uno.
Más útil para material crudo o entero, no procesado. No siempre útil para material procesado, debido a la desnaturalización de las proteínas por el calor.

Conveniente para detectar el flujo del gen en cosechas convencionales de la misma especie, pero la proteína puede ser expresada en una forma modificada o no ser expresada en todos, si la construcción se realizó en una especie de planta diferente.






centrifugacion
La centrifugación es un método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos de diferente densidad mediante una fuerza rotativa , la cual imprime a la mezcla con una fuerza mayor que la de la gravedad, provocando la sedimentación de los sólidos o de las partículas de mayor densidad. Este es uno de los principios en los que la densidad: Todas lículas, por posa, sectadas por cualquier y una extensa variedad de técnicas derivadas de esta. Donde la fuerza es mayor a la gravedad.
Fundamento teórico
El objetivo de la centrifugación es separar sólidos insolubles(de particulas muy pequeñas dificiles de sedimentar)de un liquido. Para ello, se aplica un fuerte campo centrífugo, con lo cual las partículas tenderán a desplazarse a través del medio en el que se encuentren con la aceleración G. E=velocidad angular2 x radio de giro.
Tipos de centrífugas
Los aparatos en los que se lleva a cabo la centrifugación son las centrífugas. Una centrífuga tiene dos componentes esenciales: rotor (donde se coloca la muestra a centrifugar) y motor. Existen dos tipos de rotores:
• De ángulo fijo: Los tubos se alojan con un ángulo fijo respecto al eje de giro. Se usa para volúmenes grandes.
• Basculante: Los tubos se hallan dentro de unas carcasas que cuelgan. Estas carcasas están unidas al rotor con un eje y cuando la centrífuga gira, se mueven. Se usan para volúmenes pequeños y para separar partículas con un mismo o casi igual coeficiente de sedimentación.
Las centrífugas están metidas en el interior de una cámara acorazada a unos 4ºC. Si esta cámara no estuviese presente, al comenzar la centrifugación, y debido al rozamiento con el aire, subiría la temperatura de la muestra y podría llegar a desnaturalizarse.
Una centrífuga debe tener las masas de las muestras compensadas unas con otras. En caso contrario, la centrífuga podría "saltar por los aires". Aunque hoy en día, para que esto no ocurra, casi todas las centrífugas se detienen si las masas no están compensadas.
Existen dos grandes grupos de centrífugas:
Analíticas: Con las que se obtienen datos moleculares (masa molecular, coeficiente de sedimentación, etc.). Son muy caras y escasas.
Preparativas: Con las que se aíslan y purifican las muestras. Hay 4 tipos de centrífugas preparativas:
• De mesa: Alcanzan unas 5.000 rpm (revoluciones por minuto). Se produce una sedimentación rápida. Hay un subtipo que son las microfugas que llegan a 12.000-15.000 rpm. Se obtiene el precipitado en muy poco tiempo.
• De alta capacidad: Se utilizan para centrifugar volúmenes de 4 a 6 litros. Alcanzan hasta 6.000 rpm. Son del tamaño de una lavadora y están refrigeradas.
• De alta velocidad: Tienen el mismo tamaño que las de alta capacidad y llegan a 25.000 rpm.
• Ultracentrífugas: Pueden alcanzar hasta 100.000 rpm. También están refrigeradas. Son capaces de obtener virus.
Tipos de centrifugación
• Centrifugación diferencial: diferencia en la densidad de las moléculas. Esta diferencia debe ser grande pervada al centrifugar: Las partículas que posean densidades similares sedimentaraíficoiza como centrifugación preparativa para separar ponentes en la mezcla (por ejemplo, para separar mitocondrias de núcleos y membrana)útil para separar moléculas.
• Centrifugación isopícnica: Partículas con el mismo coeficiente de sedimentación se separan al usar medios de diferente densidad. Se usa para la separación de ADN con mucha frecuencia.
• Centrifugación zonal: Se separan partículas con distinto coeficiente de sedimentación por la acción de determinados tampones.
• Ultracentrifugación...: Permite estudiar las características de sedimentación de estructuras subcelulares (lisosomas, ribosomas y microsomas) y biomoléculas. Utiliza rotores (fijos o de columpio) y sistemas de monitoreo. Existen diferentes maneras de monitorear la sede las partículas en la ultracentrifugación, el más común de ellos mediante luz Uerfresones.